微生物量碳 微生物量氮检测
土壤生态系统中存在着大量的微生物群落，它们对土壤中物质的转化和能量的流动起着重要的作用。在土壤生态系统中，土壤微生物生物量是土壤有机质和土壤养分转化与循环的动力，并参与有机质的分解、腐殖质的形成，调控土壤中能量和养分循环等各个生化过程。
土壤微生物生物量碳、微生物量氮、微生物量磷是重要的土壤活性碳、氮、磷的“库”和“源”，直接调节土壤碳、氮、磷元素的供给。目前科锐思博生物采用氯仿熏蒸—K2SO4浸提法（Fumigation-extraction, FE）的方法来检测土壤中微生物量碳、微生物量氮、微生物量磷。
具体采样、检测和数据统计问题，可以咨询技术支持。
| 序号 | 微生物量 | 检测方法 | 数量 | 样本状况 |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 微生物量碳 | 氯仿熏蒸浸提法 | 200g | 鲜土 |
| 2 | 微生物量氮 | 氯仿熏蒸浸提法 | 200g | 鲜土 |
| 3 | 微生物量磷 | 氯仿熏蒸浸提法 | 200g | 鲜土 |
1 土壤样本采集
根据实验目的，采集不同深度的土壤样本，采用五点法混合样本。之后过2mm土壤筛，去除土壤中的根系、叶片、石子等杂质。每个样本采集200g鲜土，在寄送样本时，请采用冰盒（冰袋+泡沫盒）对样本进行保存。
2 氯仿熏蒸法
2.1 基本原理
土壤经氯仿熏蒸处理时，土壤中微生物的细胞膜被氯仿破坏而被杀死，细胞破裂后，细胞内容物释放到土壤中，导致土壤中可提取碳、氨基酸、氮、磷等大幅增加。通过测定浸提液中全碳的含量，可以计算土壤微生物的生物量碳。通过检测浸提液中全氮的含量，可计算微生物氮含量。浸提液中的碳可以用重铬酸钾容量法测定。
土壤样本经氯仿熏蒸和未熏蒸两种不同处理后，用K2SO4溶液浸提，浸提液一部分用K2CrO7氧化法测定微生物量碳，另一部分用浓H2SO4消煮、碱化蒸馏法测定微生物量氮。
2.2 仪器及设备
培养箱、真空干燥器、抽气机、大铝盒、分析天平、小烧杯（50ml）、大塑料瓶（250ml）、三角瓶（150ml）、真空泵、往复式震荡机、4℃冰箱、DOC测定仪（冷凝装置4套、配套沸瓶装16个）、玻璃沸珠、1500W电炉、滴定管（25ml）、变压器、烘箱、蒸馏定氮仪、开氏瓶（50ml）、移液管（2ml、5ml、50ml）、小漏斗
2.3 试剂
- 无醇氯仿：用NH2SO4溶液与氯仿按体积比2:1于分液漏斗中震荡混匀，静置分离，共做3次。再用水代替硫酸于氯仿2:1混匀，震荡分离，共5次，将提纯的氯仿放入棕色试剂瓶中，加一勺无水硫酸钠，保存。
- 硫酸钾溶液（c(K2SO4)=0.5molL-1）：取87.10g分析纯硫酸钾溶解于蒸馏水中，定溶至1L。
- 混合酸（浓硫酸：浓磷酸=2:1，分析纯）。
- 重铬酸钾标准溶液（c(K2CrO7)=0.1molL-1）：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾4.903g，用蒸馏水溶解并定溶至1L。
- 重铬酸钾标准溶液（c(K2CrO7)=0.4molL-1）：取经130℃烘2-3小时的分析纯重铬酸钾19.612g，用蒸馏水溶解并定溶至1L。
- 邻啡罗啉指示剂：取邻啡罗啉指490g溶于含有0.700g分析纯硫酸亚铁（FeSO4•7H2O）的100ml蒸馏水中，此溶液易变质，应密闭保存于棕色瓶中。
- (NH4)2Fe(SO4)2溶液(0.02 molL-1)：称取15.69g溶于蒸馏水，用20ml浓硫酸（98%，分析纯）酸化，定容至1L。
- 硫酸铜溶液[c(CuSO4)= 0.19molL-1]：称取30.324g 分析纯硫酸铜（CuSO4）溶于蒸馏水，定容至1L 。
- 氢氧化钠溶液[c(NaOH)= 10molL-1]：400g 分析纯氢氧化钠溶于蒸馏水，定容至1L 。
2.4 实验步骤
2.4.1 土壤熏蒸
称取12.50g新鲜土壤于大铝盒中。在抽气皿中放入盛有25ml无醇氯仿的小烧杯，在小烧杯中放入几张小纸片以便观察沸腾。放入盛有土壤样本的大铝盒，连上抽气机，抽真空使氯仿沸腾5分钟，关紧活塞，关闭抽气机。包上黑布，至于阴暗处（25℃），熏蒸24小时。到时间后，取出小烧杯后，反复抽真空2-3次（每次5分钟），排除氯仿。
再熏蒸开始的同时，另取一批同等重量的土壤放入塑料瓶中，不做熏蒸处理，同样包上黑布，至于阴暗处24小时。
2.4.2 土壤浸提
将上述2批土样分别转移到离心管中。每个离心管中分别注入50ml K2SO4溶液进行浸提，盖紧瓶盖，震荡30分钟，离心5分钟后取出。浸提液用15ml定量滤纸过滤到150ml三角瓶，应立即测定。如不立即测定，则用保鲜膜封口（防止污染和挥发），放入4℃冰箱进行保存。
2.4.3 微生物量碳的测定--K2CrO7氧化法
分别吸取2ml 0.4 mol·L-1的K2CrO7溶液和15ml混合酸放入沸瓶，加入等量的玻璃球。吸取8-10ml浸提液，放入电炉上，安装好冷凝系统，调压至130伏开始加热。从玻璃球沸腾时开始计时，保存沸腾30分钟，期间应摇匀两次。在30分钟到前2分钟关闭电炉，利用余热继续保存沸腾30分钟，随后从冷凝管上口加入20ml蒸馏水，清洗冷凝管壁，降低沸瓶温度。
取下沸瓶，待冷却至室温，加入2-3滴指示剂，用准确标定过的(NH4)2Fe(SO4)2溶液进行滴定。颜色从黄色à深绿色à天蓝色à淡灰色à红棕色à终点。同时用0.5 mol•L-1 K2SO4代替浸提液做空白，注意两个电炉之间的差异。
注：(NH4)2Fe(SO4)2溶液的标定：在三角瓶中放入0.1 mol·L-1K2CrO7标准溶液10ml，加入混合酸15ml，摇匀冷却，用(NH4)2Fe(SO4)2溶液滴定，颜色反应同上。一般在测定开始和结束时各标定一次，取平均值。
结果计算：
- C（ug/ml）=[(V空白-V样本)*N(NH4)2Fe(SO4)2*3*1000]/吸取样品的体积数（ml）
- C（ug/g）=[C(ug/ml)*浸提液的总体积数(ml)]/W干土(g)
- EC（ug/g）=C熏蒸(ug/g)-C未熏蒸(ug/g)
- 微生物量碳BC（ug/g）=EC/0.38（ug/g）
2.4.4 微生物量氮的测定—消煮、碱化蒸馏法
吸取浸提液25-30ml放入开氏瓶中，加入2ml浓硫酸（固定浸提液中的氨）。放入烘箱在60-70℃烘干2-3天，直至瓶内还剩下3ml左右溶液，取出。加入3ml浓硫酸和1ml 0.19 mol·L-1 CuSO4溶液，放上小漏斗在电炉上进行消煮。消煮至瓶内颜色呈天蓝色为止，取下冷却。同时用0.5mol L-1 K2SO4 溶液50ml代替浸提液作为空白对照。
用去离子水清洗小漏斗内外壁，少量多次冲洗开氏瓶，将开氏瓶中的液体全部转移到定氮仪中，加入20ml 10mol L-1 NaOH 溶液进行碱化蒸馏，冷凝管下口放装有5ml硼酸指示剂的小三角瓶，接受蒸馏液，待蒸馏液达到60ml时，停止蒸馏。蒸馏前应检查蒸馏装置是否漏气，并进行空蒸馏清洗管道。
用0.02 mol L-1 硫酸标准溶液滴定蒸馏液，加入指示剂，颜色由蓝色刚变为紫红色为终点，记录消耗硫酸标液的体积。
结果计算：
（1）N（ug/g）=[(V-V0)*NH2SO4*14.0*稀释倍数*1000*2.22]/W干土
（2）微生物量氮BN（ug/g）=N熏蒸-N未熏蒸
其中：
V：滴定样本所消耗的硫酸体积，ml；
V0：滴定空白样本所消耗的硫酸体积，ml；
稀释倍数：总浸提液是所吸取的浸提液的倍数；
2.22：无机氮转化为有机氮的转化系数。
